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무세포 단백질 합성계

Human Cell-Free Protein Expression System

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제조사 제품코드 제품명 용량 가격
(부가세별도)
비고 사용자매뉴얼
Takara
3281
Human Cell-Free Protein Expression System
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10 회
602,000원  52970
Takara
3290
pT7-IRES His-N DNA
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20 μg
313,000원  52967
Takara
3291
pT7-IRES His-C DNA
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20 μg
313,000원  52968
Takara
3292
pT7-IRES Myc-N DNA
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20 μg
313,000원  52969

  • 사람 세포주 유래의 세포 추출액을 이용한 무세포 단백질합성시스템
  • IRES서열의 이용, 번역증강인자 효과를 이용해 합성량 향상
  • 150 kDa이상의 고분자 단백질 합성에도 응용 가능
  • 별도 판매되는 vector를 이용하여 His-Tag나 c-Myc-Tag를 추가한 목적 단백질 발현도 가능
제품설명
Human Cell-Free Protein Expression System(code 3281)은 사람 세포주 유래의 세포 추출액을 이용한 무세포 단백질 합성시스템이며, 하나의 튜브에서 RNA 전사로부터 단백질 합성까지 실시할 수 있다.
본 시스템의 Cell Lysate에는 in vitro에서 단백질 합성반응에 필요한 각종 인자(리보솜, 번역 개시 • 신장 인자, tRNA등)가 포함되어 있다. 이 cell lysate에 목적유전자를 클로닝한 T7-IRES Vector와 T7 RNA Polymerase, Mixture-3(APT등과 아미노산류), Mixture-2(번역증강인자)를 첨가하는 간단한 과정만으로 실험이 가능하다(그림 1). 본 시스템에서는 목적 유전자의 전사 반응과 번역 반응이 동일 튜브내에서 이루어지므로, 2단계 반응과정에서 우려되는 mRNA의 분해를 최소화 할 수 있다. 또, 일반적인 토끼 망상적혈구(rabbit reticulocyte)를 이용한 무세포 단백질 합성시스템보다 합성 효율이 높고, 합성량의 증가를 기대할 수 있어(그림 2), 150~200 kDa의 고분자 단백질 합성에도 이용할 수 있다(그림 3).
이 시스템은 Single-Step 반응을 이용한 High-throughput 단백질 합성 외에도 세포 발현시 숙주 세포의 성장 및 세포 기능에 영향을 미치는 독성 단백질 합성에도 응용할 수 있다. 그림 1
그림1. Human Cell-Free Expression System모식도

반응액[Cell Lysates*, T7 RNA Polymerase, Mixture-1, Mixture-2(번역 증강 인자), Mixture-3(ATP등이나 아미노산류)]에 목적 유전자를 클로닝한 pT7-IRES Vector를 첨가하는 간편한 1 튜브 반응으로, mRNA의 전사로부터 단백질 합성까지를 one-step으로 실시할 수 있다.
* Cell Lysate 에는in vitro 단백질 합성 반응에 필요한 리보솜, 번역 개시 • 신장 인자, tRNA 등의 각종 인자가 포함되어 있다.

본 시스템으로 이용하기 위해서 His-Tag나c-Myc-Tag를 포함한 발현벡터도 별도 판매하고 있다. 이러한 발현 벡터는 T7프로모터와 EMCV IRES서열 말단에 His-Tag나c-Myc-Tag등의 Tag 서열, Factor Xa절단 서열, MCS, polyA 시그널, T7 terminator를 포함하고 있다. Tag 종류, 서열 위치가 다른 3종류의 벡터가 있으며, 목적에 맞는 최적의 벡터를 선택할 수 있다.
예를 들면, pT7-IRES His-N DNA(code 3290)는 목적 단백질의N말단에, pT7-IRES His-C DNA(code 3291)는 목적 단백질의 C말단에, His-Tag를 가지고 있는 단백질 발현이 가능하다. His-Tag를 이용하여 정제 후, 발현된 단백질로부터His-Tag를 제거할 수 있는 Factor Xa절단 서열도 포함하고 있다. 또, pT7-IRES Myc-N DNA(code 3292)는 목적 단백질의N말단에c-Myc-Tag를 가지고 있는 단백질의 발현이 가능하고, 동일한Factor Xa절단 서열을 가지고 있다. (Vector map 참조)
이러한 벡터의 MCS에 프레임을 맞추어 삽입한 목적 유전자는T7프로모터의 제어하에서 EMCV IRES를 가지는 RNA로 전사되어, EMCV IRES의 번역 개시 촉진 효과에 의해 본 cell-free protein expression(무세포 단백질 발현)시스템에서 효율적인 고발현이 가능하다.
내용
Human Cell-Free Protein Expression System(code 3281)
1. Cell Lysate*1 100 μl
2. Mixture-1 60 μl
3. Mixture-2*2 10 μl
4. Mixture-3*2 20 μl
5. T7 RNA Polymerase (200 U/μl) 10 μl
6. pT7-IRES Vector (0.5 μg/μl) 20 μl
7. Control Vector*3 (0.3 μg/μl) 5 μl

*1 : 사용 직전에 녹여서 피펫등으로 부드럽게 충분히 섞은 후 즉시 사용하고, 사용 후에는 즉시 -80℃에 보관한다.
(주의) 5회 정도의 동결융해로는 성능이 저하되지 않는 것을 확인하였지만, 가능한 분주하여 보관할 것을 권장합니다..
*2 : Mixture-2및Mixture-3는 단백질을 포함하고 있으므로, 과도한 교반 등 단백질의 실활을 초래하는 조작은 피해야 한다. Mixture-2에 포함되어 있는 단백질에는HN-Tag 서열이 첨가되어 있다.
*3 : β-Galactosidase 유전자가 포함되어 있다.
보존
code 3281 ; -80℃
code 3290,3291,3292 ; -20℃
Vector Map
그림 2
* Human Cell-Free Protein Expression System에 포함 되어 있음.
그림 3
Vector 서열정보
pT7-IRES(Fasta형식)
pT7-IRES_His-N(Fasta형식)
pT7-IRES_His-C(Fasta형식)
pT7-IRES_Myc-N(Fasta형식)

Fasta형식 : 상동서열검색의 데이타베이스나 서열을 취급하는 각종 툴을 사용할 때에 사용되는 파일 형식으로, 첫번째 행의 >뒤에 파일 정보(벡터명)를 넣는다. 서열은 60염기마다 행을 바꾼다.
IRES 서열 이용과 독자적인 번역 증강 인자를 이용한 높은 번역 효율 유지
pT7-IRES Vector로부터 전사되는 목적 유전자RNA에는 단백질의 번역 개시를 촉진하는 IRES서열이 포함되어 있다. 또한, 반응액에 첨가되는 고유의 번역 증강 인자는, 단백질 합성과 함께 불활성화된 번역 개시 인자를 재활성화하여, 번역 저하를 억제하여 높은 번역 효율을 유지한다. 이러한 번역효율 증강효과에 의해, 본 시스템에서는 기존의 토끼 망상적혈구(Rabbit reticulocyte)를 이용한 무세포 단백질 합성 시스템의 단점이었던 낮은 합성률이 향상시켰고, 150 kDa이상의 고분자 단백질의 합성에 응용 가능함을 확인하였다. (그림2, 그림3).
그림 4

그림2. Human Cell-Free Protein Expression System과 토끼 망상적혈구를 이용한 무세포 단백질 합성 시스템에서의 β-galactosidase 합성량 비교
각각의 프로토콜에 따라 β-galactosidase 합성 반응을 화학 발광 기질을 이용해 측정했다. 그 결과, 토끼 망상적혈구를 이용한 무세포 단백질 합성에 비해, 사람 세포주 유래의 본 시스템에서 매우 높은 수준의 단백질이 합성되는 것을 확인하였다.

그림 5

그림3. 본 시스템을 이용한 고분자 단백질(170 kDa, 200 kDa) 발현
본 시스템을 이용해 고분자단백질을 합성하였다. SDS-PAGE후, CBB염색으로 목적 단백질을 검출한 결과, 원하는 크기(170 kDa, 200 kDa)의 단백질을 확인할 수 있었다.
Lane 1: Negative Control
Lane 2: Human Dicer(200 kDa)
Lane 3: Human eIF4G(170 kDa)
용도
  • 고분자 단백질 합성
  • 기능성 단백질 합성
  • 독성 단백질 합성
  • cDNA산물의 포괄적인 스크리닝
  • 단백질/단백질 상호작용 분석
  • 단백질/DNA상호작용 해석
  • 단백질의 변이 도입 분석
주의 사항
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