Tips for successful lentiviral transduction

얼마나 많은 상등액을 사용해야 목적하는 multiplicity of infection (MOI, transduction시 세포당 감염되는 바이러스의 수를 의미)를 달성할 수 있는 지 결정하기 위해 상등액의 infectious unit (IFU)을 측정하는 것은 매우 중요하다.
역가측정 방법은 functional 방법과 physical (non-functional) 방법으로 크게 나눌 수 있다.
Non-functional 방법으로는 p24 ELISA법, 바이러스 게놈 RNA의 RT-qPCR이나 Northern blotting법 등이 있다. ELISA와 RT-qPCR법은 빠르고 쉬우며 바이러스 준비과정에 일관성이 있다는 장점이 있다. 다만 free p24 단백질, 바이러스 RNA, 불완전하거나 비어 있는 바이러스 입자가 상등액에 존재하여, 역가가 실제보다 더 높게 평가되는 경향이 있다. 따라서 non-functional titer는 p24 또는 게놈 역가 측정값이 감염성과 어떻게 연관되는 지에 대해 이전 실험을 기반으로 계산한 후 사용해야 한다.
Functional 역가 (infectious titer)는 감염성을 가진 온전한 바이러스만을 측정하며 역가는 infectious units per ㎖ (IFU/㎖) 또는 transducing units per ㎖ (TU/㎖)으로 표시된다. Functional 방법은 항생제 선별 후 콜로니 형성 단위 (colony forming units) 측정 또는 형광 단백질을 포함하는 lentivirus를 transduction 후 세포를 flow cytometry로 카운팅 하는 방법으로 측정한다. Lentivirus가 항생제 내성 유전자나 형광단백질을 발현하지 않는 경우에는 qPCR로 세포에 integration된 provirus DNA의 카피수를 검출하는 것이 functional titer를 확인하는 가장 빠르고 쉬운 방법이다.

Titration by RT-qPCR
Lenti-X™ qRT-PCR Titration Kit는 4시간 안에 RT-qPCR 분석을 통해 ㎖ 당 바이러스 RNA 게놈의 copy를 측정하며, 바이러스 RNA 정제 후 Real Time PCR로 절대정량 하는 과정으로 진행한다. 단 모든 copy 수가 감염성 있는 바이러스의 수를 대변하지 않고, 실제 IFU/㎖은 낮을 수 있다는 점은 유의해야 한다. 정확한 상관 관계는 사용된 각 construct, 패키징 시스템과 패키징 조건 등에 따라 달라지나 이러한 상관 관계가 확립되면 여러 가지 요인이 동일하게 유지되는 시스템 간에는 동일한 construct에 대한 바이러스 copy/㎖에서 IFU/㎖값을 산출할 수 있다.


Titration by ELISA
Lenti-X™ p24 Rapid Titer Kit는 약 4시간 내에 ㎖당 바이러스 입자를 측정하는 데 사용할 수 있는 p24 기반의 ELISA kit이다. RT-qPCR 분석과 유사하게 각 바이러스 입자가 반드시 감염성을 가지고 있는 것이 아니기 때문에 실제 IFU/㎖은 낮을 수 있다는 점은 유의해야 한다. 정확한 상관 관계는 사용된 각 construct, 패키징 시스템과 패키징 조건 등에 따라 달라지나 이러한 상관 관계가 확립되면 여러 가지 요인이 동일하게 유지되는 시스템 간에는 동일한 construct에 대한 바이러스의 p24 pg/㎖에서 IFU/㎖값을 산출할 수 있다.


패키징 세포 배양 상등액의 p24 단백질을 측정하는 또 다른 역가측정 제품으로는 Lenti-X™ GoStix™ Plus이 있다. 본 제품은 약 10분 만에 빠르게 간이역가를 측정할 수 있어, 바이러스 생산량이 사용 가능한 수준인지 또는 바이러스 회수에 적절한 시점인지를 모니터링 하는 데 적합하다.

Titration by flow cytometry
형광단백질을 발현하는 다양한 Lenti-X™ vector를 이용하면 세포에 transduction하고 24~48 시간 후에 flow cytometry로 형광을 발현하는 세포 수를 카운팅할 수 있다.

Antibiotic selection
Selection marker를 포함하는 Lenti™-X vector를 이용하면 serial dilution된 바이러스를 세포에 감염시킨 후 적절한 항생제로 stable transductants (형질전환체)를 선별할 수 있다. 역가는 selection 후 확인되는 항생제 내성 콜로니의 수로 계산한다. 일반적으로 이 방법으로 측정되는 역가는 항생제 선별 중에 세포에 가해지는 스트레스와 콜로니 expansion 중에 형질전환체의 유실때문에 flow cytometry에 의한 역가보다 낮을 수 있다.

Titration of proviruses
타겟 세포의 DNA로 integration된 바이러스 게놈을 의미하는 provirus를 측정하는 방법이 가장 정확한 functional titer를 제공한다. 서로 다른 세포 타입에 따라 transduction 효율이 다를 수 있어 바이러스 패키징 상등액에서 바이러스 역가를 측정하는 것이 간혹 한 세포 타입과 다른 세포 타입에 transduction 하는 데 필요한 바이러스 양을 정확히 추측하지 못할 수 있다.

예를 들어 HT1080 세포는 Jurkat 세포보다 더 쉽게 lentivirus transduction을 진행할 수 있다. 따라서 동일한 양의 바이러스 상등액을 사용하면 Jurkat 세포에 integration되는 provirus가 훨씬 적고, multiplicity of infection (MOI)이 낮아진다. 이러한 경우도 functional titer를 정확하게 측정할 수 있도록 integration된 provirus의 카피 수를 측정하는 Lenti-X™ Provirus Quantitation Kit를 추천한다.

Lenti-X™ expression system을 사용하면, 적절한 조건 하에서는 >108 IFU/㎖ 역가의 lentivirus를 생산할 수 있고, pLVX vector의 cPPT/CTS 및 WPRE 서열과 wild-type HIV-1 LTR은 모두 더 높은 역가의 바이러스 생산에 기여한다. 10개의 다른 형광단백질로 수행된 13번의 독립적인 패키징 테스트에서 Lenti-X™ 시스템을 사용하여 패키징된 pLVX vector를 HeLa 세포에 transduction하여 flow cytometry 분석한 결과, 평균 역가는 1.85 x 108 IFU/㎖임을 확인하였다.
만약 IFU/㎖ 역가가 낮으면 Lenti-X™ Concentrator를 사용하여 바이러스 상등액을 최대 100배까지 농축할 수 있다. 이 방법은 초원심분리보다 스케일업이 쉽고, 실험방법이 빠르고 간편하며 또한 특수한 기기를 필요로 하지 않는다. 만약 역가가 낮다면, 역가를 높여 transduction 효율을 증가시킬 수 있도록 실험 조건을 검토하고, 우선 패키징 효율 저하를 유발하는 실험단계의 요인을 체크하도록 한다.

Vector
ㆍ Features of the transfer vector
Vector에 포함된 각기 다른 서열 (예, LTRs, WPRE, cPPT/CTS 등)의 존재 유무는 패키징 효율과 생산된 바이러스의 역가에 영향을 미칠 수 있다. 당사의 pLVX 벡터는 역가와 발현 모두에 최적화 되어 있으며, 다른 벡터 시스템보다 높은 역가를 생성한다. Lenti-X Packaging System은 HIV-1 기반의 lentivirus 생산 시 가장 높은 역가를 제공할 가능성이 크다. 당사의 렌티바이러스 시스템 외에 다른 시스템을 사용하는 경우, 사용목적에 대해 제 3자의 허가가 필요한 지 반드시 확인 바랍니다.

ㆍ Vector integrity
LTR의 상동서열로 인해 모든 lentivirus는 E. coli의 특정 균주에서 재조합 성향을 가지므로 재조합 빈도가 낮은 균주의 사용을 추천한다 (예, Stellar™ Competent Cells). 또한, E. coli에서 증폭한 후의 vector integrity를 확인하기 위해 적절한 제한효소로 잘라서 확인해 볼 것을 추천한다.

ㆍ Target gene
목적 유전자가 293T 세포의 정상적인 성장을 방해하는 경우 (예, 독성 유전자), 바이러스의 역가에 영향을 미칠 수 있다. 또한 유전자의 크기가 크면 LTR 사이의 거리가 멀어져 패키징 효율이 떨어질 수 있다. Wild-type 렌티바이러스는 5’ LTR의 시작부터 3’의 LTR 끝까지 9.7 kb 크기의 게놈을 가지고 있는데, 이보다 더 큰 유전자를 포함하는 구조를 가지면 불안정한 바이러스 입자가 생성되어 역가가 감소될 수 있다. 또한 패키징 중 바이러스 게놈 RNA가 조기 절단 가능성을 배재하기 위해 poly A signal을 피해야 한다.

Collection time
패키징을 위한 transfection 후 배지를 교환한 다음 24~48시간 후 바이러스를 회수하며, 바이러스 역가는 일반적으로 transfection 후 48시간이 가장 높다고 알려져 있다. Lenti-X™ GoStix™ Plus를 사용하면 상등액에 충분히 lentivirus가 생산되었는 지 또는 바이러스 상등액 회수를 위해 더 기다려야 하는 지를 쉽게 모니터링 할 수 있다.


Packaging cells
Lenti-X™ 시스템을 이용한 바이러스 패키징에는 Lenti-X™ 293T Cell Line을 추천한다.

Transfection
ㆍ Quality and amount of plasmid used for transfection
패키징 플라스미드와 transfection 시약이 premix, 분주된 동결건조 시약인 Lenti-X™ Packaging Single Shots (VSV-G)의 프로토콜에는 7 ㎍의 transfer vector DNA를 사용하므로, 다양한 정제 제품을 이용하여 "transfection-grade" transfer vector DNA를 정제할 것을 강력히 권장한다.

ㆍTetracycline-contaminated serum
Lenti-X™ Packaging Single Shots (VSV-G)은 Tet-Off transactivation을 사용하므로, 패키징은 tetracycline이 없는 조건에서 수행되어야 하고, 그렇지 않은 경우 Tet-Off transactivator의 활성이 감소해서 역가가 낮아진다.
     - Tet System Approved FBS, US-Sourced (#631105 외)의 사용을 추천한다.

Removing inhibitors
Lenti-X™ Maxi Purification Kit는transduction 저해물질을 제거하는 데 탁월하고, 상등액의 용량에 따라 바이러스가 약 10배 농축되는 효과가 있다.



Improving cell-virus contact
세포 타입에 따라 RetroNectin^® (Recombinant Human Fibronectin Fragment) 시약의 사용을 고려해볼 수 있다. RetroNectin bound virus (RBV) 프로토콜은 배지에서 transduction 저해물질을 제거하며 바이러스 입자와 세포 간의 거리를 좁혀 transduction 효율을 높여준다. RetroNectin 시약은 효과적인 transduction enhancer로, suspension cell과 T cell, B cell, monocytes, NK cells, eosinophils, bone marrow monocytic cells, lymphoid progenitors, thymocytes, activated T-cells, mast cells 등 VLA-4 또는 VLA-5를 발현하는 세포 타입에 적용할 수 있다. 기존 제품과 성능과 프로토콜을 그대로, 가격이 다운된 RetroNectin^® Pro (Recombinant Human Fibronectin Fragment)도 있다.



Lenti-X™ Transduction Sponge는 다공성 alginate (알긴산)로 구성된 스펀지로 간편하게 lentivirus transduction을 촉진한다. 스펀지의 다공성 microfluidics 구조는 세포와 lentivirus간 물리적 거리를 좁혀 spinoculation이나 chemical enhancer (e.g. Polybrene) 없이도 세포 독성을 최소화하면서 빠른 시간 안에 효과적으로 transduction을 진행한다. 특히 형질도입이 어려운 cell-line (부착형, 부유형 세포 모두 가능) 및 primary cell 등 다양한 세포에 transduction을 진행할 수 있다. (T cell 전용 sponge : Lenti-X™ T-Cell Transduction Sponge)



Lenti-X™ Accelerator를 사용하면 transduction 속도를 높일 수 있어 민감한 세포가 바이러스 포함 배지와 Polybrene에 노출되는 시간을 줄일 수 있다. 기존의 lentivirus transduction은 세포와 바이러스, Polybrene을 overnight 배양했던 반면, Lenti-X™ Accelerator를 사용하면 Polybrene 없이 단 30분 만에 transduction을 완료할 수 있다.



Ecotropic Receptor Booster는 Ecotropic 바이러스로 감염시키고자 하는 모든 타겟 세포의 표면에 Ecotropic 수용체 단백질인 mCAT01의 밀도를 일시적으로 높이는 데 사용한다. 이를 통해, 예를 들면 설치류 세포에만 감염 가능한 ecotropic retrovirus 또는 ecotropic lentivirus를 인간 세포에 효율적으로 transduction 할 수 있다. 본 기술은 바이러스 감염 내성이 있는 모든 세포 타입의 감염 효율을 높이는 데 활용할 수도 있다.



마지막으로, 세포와 바이러스간의 접촉을 최대화하기 위해 transduction 중 간단한 centrifugation 단계 (예, spinfection)을 권장하며, 이 과정을 통해 transduction 효율을 2~10배 향상시킬 수 있다.
(자세한 내용은 Lenti-X™ Lentiviral Expression System User Manual을 참조)