• Input sample amount
  - Peripheral blood mononuclear cell (PBMC)로부터 추출한 10 ng - 1 μg total RNA
  - B cell로부터 추출한 1 - 100 ng total RNA
• PCR error, duplication error 또는 sequencing error로부터 파생된 reads 제거 목적의 UMI based correction
• 최적화된 cDNA library 제작법으로 아주 민감하고 특이적인 BCR clonotype 검출
• Human IgG subclass만 특이적으로 정확하게 증폭하여 염기서열 분석
• 동일 샘플의 다양한 사슬 (Chain; IgG, IgM, IgK, IgL)의 정밀한 검출을 위해 최적화된 PCR Pooling Strategy
• 시퀀싱 데이터 분석을 위한 Takara Bio Immune Profiler Software 제공

제품설명

SMARTer^® Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit은 5’ RACE법 (Rapid Amplification of cDNA Ends)과 NGS 기술을 조합한 제품으로써, RNA 샘플로부터 아주 민감하고 정확한 BCR profiling을 위해 최적화된 프로토콜을 제공한다. 5’ RACE 방법은 BCR heavy chain 또는 light chain의 constant region을 특이적으로 타겟할 수 있어, 편향성을 현저히 줄일 수 있다. 즉, 본 제품을 이용하면 BCR 전사체의 V(D)J 가변영역을 특이적으로 캡쳐하여 증폭할 뿐만 아니라, B-cell repertoire를 매우 민감하고 재현성 높게 분석할 수 있다.
본 제품은 peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)에서 추출한 10 ng - 1 μg total RNA 또는 B cell로부터 추출한 1 - 100ng total RNA로부터 고품질의 Illumina^®-ready library를 제작 가능하며, Human immunoglobulin IgG, IgM의 heavy chain과 light chain (kappa and lamda)을 모두 분석 가능하다. 본 제품은 PCR 오류, duplicate, 시퀀싱 오류에서 기인하는 sequence reads를 제거할 수 있는 unique molecular identifiers (UMI) 기술을 포함하고 있어 보다 정확하고 신뢰성 높은 데이터를 얻을 수 있다.
시퀀싱 이후에는 UMI-based error correction을 위한 Takara Bio Immune Profiler Software를 이용하여 데이터를 분석할 수 있다. 이 소프트웨어는 clonotype count, 동정 및 V(D)J) 영역의 서열 분석 등을 포함한 고품질의 BCR profiling 분석을 제공한다.



그림 1. SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit workflow
Panel A. SMARTScribe Reverse Transcriptase는 1^st strand cDNA가 합성하며, mRNA의 5’ 말단에 이르면 nontemplated nucleotide (3’-xxxxx-5’)가 합성된 cDNA의 3’ 말단에 부가된다. 이렇게 부가된 nontemplated nucleotide에 SMART UMI Oligonucleotide가 결합하고, 추가적인 역전사 반응에 의하여 nontemplated nucleotide 및 SMART UMI Oligonucleotide 서열과 상보적인 염기를 cDNA에 부가 합성한다 (Template-switching step). 이 과정에서 합성된 1^st strand cDNA는 두 단계의 gene specific PCR amplification 과정을 거치게 된다 (Panel B 참조)

Panel B. 첫번째 단계의 PCR에서는 1^st strand cDNA를 주형으로 하여, Illumina Read Primer 2 서열에 상보적인 염기서열을 가진 forward primer (PCR1 Universal Forward Primer)와 BCR heavy/light chain의 constant region에 상보적인 염기서열을 가진 reverse primer (PCR1 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primers)을 이용한다. 즉, 첫번째 단계의 PCR에서는 BCR Heavy chain 또는 light chain의 constant region 부위와 가변영역 전체에 대한 증폭산물을 얻을 수 있다. 또한 두번째 단계의 PCR은 첫번째 PCR 산물을 주형으로 하며, BCR heavy/light chain의 constant region과 가변영역 전체 부분을 증폭하기 위한 semi-nested primers (PCR2 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primers를 이용한다.


그림 2. Clonotype calls identified from 1-100 ng B-cell RNA.
Human CD19+ B-cell total RNA 1 ng, 10 ng, 100 ng으로부터 BCR Profiling을 위한 IgG, IgM, IgK, IgL library를 제작하였다. 데이터 분석을 위해 RNA input 1 ng, 10 ng, 100 ng library에 대하여 각각 100,000 reads, 400,000 reads, 5,000,000 reads로 downsampling 하였으며, 그 이후 Takara Bio Immmune Software를 이용해 데이터 분석하였다.


그림 3. Scatterplot showing reproducibility between libraries generated with 1 μg of PBMC RNA.
건강한 공여자의 PMBC로부터 추출한 1 μg total RNA로부터 IgG, IgM, IgK, IgL에 대한 library를 duplicate로 제작하였다. 13 million reads로 downsampling 하고 clonotype을 분석하였다. 그 결과, 모든 plot에서 2개의 library (IgG, IgM, IgK, IgL)를 확인하였으며, 높은 재현성을 보였다 (Pearson 0.98, Spearman 0.72)


그림 4. Clonotype counts from PBMC RNA obtained from different donors.
SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit를 이용하여 8명의 10 ng PMBC RNA (각각 다른 색상으로 표기)로부터 IgG, IgM, IgK, IgL clonotype을 분석하였다. 그 결과, 각각의 샘플마다 clonotype count가 다른 다양한 clonotype을 검출할 수 있었다.


그림 5. Evaluation of sequencing saturation for 10-ng PBMC RNA libraries.
SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit를 이용하여 한 명의 공여자의 10 ng PMBC RNA로부터 BCR profiling library를 제작하였다.
Panel A. UMI based-correction 유무에 따라 각기 다른 sequence depth 조건에서의 IgG clonotype count를 나타냈다 (Blue line : UMI-based correction 진행 / Purple line : UMI-based correction 진행하지 않음). IgG와 다른 사슬 (IgM, IgK, IgL - 본 표에 표현되지 않음)에 대한 sequencing library는 library당 1.5 million reads로 분석하였으며, 100만, 500K, 200K, 100K, 50K, 50K reads로 downsampling하였다. 다양한 sequence depth에 대한 서열은 Takara Bio Immune Profiler Software로 분석하였다. UMI-based correction을 이용하여 보다 정확성 높은 clonotype 검출이 가능하다.
Panel B. 각각 100K, 1,500K sequencing depth에 대한 overlapped clonotype을 확인할 수 있다.

적용

구성품 (자세한 내용은 CoA를 참조하세요)

보존