• 높은 역가의 바이러스 생산을 위한 최적의 조합
  - 실험 최적화를 위한 시간/시약 소모 불필요
• 편리한 Single shot 형태로, hands-on time을 최소화하고, error 방지
  - Single Shot에 선택한 transfer plasmid (ZsGreen1 발현/luciferase 발현)와 D.W.를 첨가하여 packaging cell에 처리하는 것 만으로 packaging 완료
• SARS-CoV-2 spike protein variant에 따른 제품 선택
  -> WT (full length) - Wuhan-Hu-1 (NC_045512.2)로부터 유래한 SARS-CoV-2 서열을 이용했으며, mammalian cell에서 발현될 수 있도록 최적화.
  -> D614G (full length) - 현재 유행하는 대부분의 바이러스에서 보이는 D614G mutation spike protein coding sequence 포함 (Isabel et al. 2020).
  -> WT (truncated) / D614G (truncated) - WT spike와 D614G spike coding sequence에서 C-termini의 ER retention signal을 제거하여 바이러스가 발현하는 spike protein이 증가하고, 높은 감염력 확인 (Johnson et al. 2020)
• Neutralization assay를 위한 no-envelope control 제공

제품설명

COVID-19 치료제 개발을 위해서는 SARS-CoV-2 감염이 억제되는지를 입증하는 것이 필요하다. 이 과정에서 SARS-CoV-2를 직접 사용하기 위해서는 안전 조치 등이 요구되기 때문에, 연구자들은 SARS-CoV-2 spike protein (Ni et al. 2020, Shang et al. 2020)을 가지는 pseudotype의 대체 바이러스를 이용할 수 있다.
Lenti-X™ SARS-CoV-2 Packaging Single Shots를 이용하면, 다카라바이오의 Lentivirus packaging 기술을 적용하여 SARS-CoV-2 spike-pseudotyped을 가지는 고역가 Lentivirus를 손쉽게 생산할 수 있다.

그림 1. ACE2-positive cell에서의 SARS-CoV-2 pseudovirus 도입 효율 확인
(Panel A) Human ACE2 receptor를 안정적으로 발현하는 HEK293T cell에 SARS-CoV-2 pseudovirus를 도입한 후, ZsGreen1을 이용해 각 spike protein 별 도입 효율을 비교하였다.
Lenti-X SARS-CoV-2 Packaging Single Shots were used to generate lentiviral particles pseudotyped with either WT (Wuhan-Hu-1) or D614G variants of the spike protein, and encoding the fluorescent protein ZsGreen1. 100 μl of supernatant from each prep was used to transduce an HEK293T cell line stably expressing the human ACE2 receptor in the presence of 6 μg/ml polybrene in 48-well plates. Transduction efficiencies for each sample were measured by flow cytometry 6 days posttransduction.
(Panel B) ACE2-positive cell과 HEK293 cell에 luciferase를 발현하는 pseudovirus를 도입한 후, 각 세포 별, spike protein 별 효율을 비교하였다.
Pseudoviruses encoding firefly luciferase were used to transduce both the ACE2-positive cell line and an HEK293T cell line lacking ACE2 expression (included to provide a background signal for analysis of luciferase activity). Luciferase activity was measured 6 days posttransduction.


그림 2. Lenti-X™ SARS-CoV-2 Packaging Single Shots로 얻은 바이러스의 functional titer 확인
(Panel A) Functional titers determined via analysis of ZsGreen1 reporter expression in ACE2-positive HEK293T cells transduced with SARS-CoV-2 pseudovirus.
(Panel B) Corresponding microscopy images of transduced ACE2-positive cells at 72 hours post-infection.


그림 3. SARS-CoV-2 spike protein variant에 따른 ACE-2 protein의 neutralizing activity 확인
(Panels A, B) ACE2 HEK293T 세포에 SARS-CoV2 pseudovirus와 ACE2-Fc 단백질을 농도별로 처리한 후, luciferase를 통해 neutralizing activity를 확인하였다.
Serial dilutions of soluble ACE2 protein fused to the Fc domain from IgG (ACE2-Fc) were applied, along with SARS-CoV-2 pseudovirus, to ACE2 HEK293T cells. Luciferase levels were measured 3 days post-infection as a readout for virus infectivity. Data are graphed as percent neutralization relative to virus-only control infection. Values are mean ±SD and experiments were performed in triplicate.

Streamlined, one-step workflow

Lenti-X™ SARS-CoV-2 Packaging Single Shots은 Xfect™ transfection 시약과 Lentiviral packaging plasmid가 최적의 비율로 혼합되어 동결건조 형태로 제공된다. 얻고자 하는 바이러스의 spike protein variant를 포함하는 single shot을 선택할 수 있고, 바이러스 도입 효율 확인을 위한 reporter가 삽입되어 있는 transfer vector (ZsGreen1 혹은 luciferase)와 D.W를 single shot과 섞어 packaging cell (e.g. Lenti-X™ 293T Cell Line)에 넣는 것 만으로 packaging이 완료된다. Transfection 후 48-72시간 후에 상층액에서 바이러스를 회수할 수 있다.

참고 문헌

제품 구성