- Cap 구조와 Poly(A) 서열을 가진 mRNA를 간편하게 합성하는 all-in-one kit*
- T7 RNA Polymerase를 이용한 고효율 in vitro transcription (IVT)을 위한 조성 최적화
(20 ㎕ 반응 당 최대 200 ㎍ mRNA 합성가능)
- Pseudouridine 등으로 변형된 mRNA도 수율 감소 없이 in vitro transcription (IVT) 가능
- In-Fusion® Snap Assembly Master Mix 적용으로 간편한 cloning
- IVT 후 template DNA를 제거하기 위한 DNase I과 합성된 mRNA를 정제하기 위한 LiCl 용액 포함
*본 제품에 Cap analog는 포함되어 있지 않습니다.
제품설명
Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)은 Cap 구조와 Poly(A) 서열을 가진 mRNA를 간편하게 고효율로 합성할 수 있는 키트로, 아래의 두 제품으로 구성되어 있다.
(1) Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)
: in vitro transcription (IVT)에 사용되는 plasmid template을 간편하게 제작
(2) Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)
: 최적화된 in vitro transcription (IVT) 시스템으로 고품질의 Capping 된 mRNA를 고수율로 합성
※이 제품에는 Cap analog가 포함되어 있지 않습니다.
본 제품은 CleanCap® Reagent AG (TriLink BioTechnologies)에 최적화되어 있으며, CleanCap® Reagent AG는 별도로 준비 바랍니다.
그림 1. Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141) workflow
(1) Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)
mRNA의 IVT용 template를 제작하기 위하여, CDS를 cloning하기 위한 선형화된 plasmid와 편리한 cloning을 위한 In-Fusion® 시약 및 control fragment (FLuc)가 포함되어 있다. 선형화된 plasmid에는 T7 promoter, transcription start sequence (AGG), 5’-UTR (untranslated region), 3’-UTR, Poly(A) 서열 (105 염기)이 포함되어 있다. 여기에 발현하고자 하는 유전자 (coding sequence: CDS)를 In-Fusion cloning하여 사람이나 마우스 등 포유류 세포에서 사용 가능한 CleanCap Reagent AG를 이용한 mRNA 합성용 주형 plasmid를 구축할 수 있다.
* Linearized Template Vector의 서열 정보는 아래 ※서열 정보를 참고해 주세요.
(2) Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)
T7 promoter 서열을 포함한 dsDNA를 template으로 IVT 반응을 통해 mRNA를 합성하기 위한 제품이다. 본 제품은 IVT 반응 후 template DNA를 제거하기 위한 DNase I과 합성된 mRNA를 정제하기 위한 LiCl 용액을 포함하고 있다. 진핵생물에서 mRNA를 protein으로 translation 하기 위해서는 5’ 말단에 Cap 구조를 필요로 한다. 본 키트는 CleanCap® Reagent AG (TriLink BioTechnologies)를 이용한 Cap 구조를 가진 mRNA 합성에 최적화 되어 있다. 또한 세포 도입 시 면역원성을 최소화하기 위해 UTP 대신 pseudo UTP를 사용하는 경우에도 mRNA의 수율 감소 없이 IVT를 진행할 수 있다.
본 제품을 사용하면 1회 반응 당 (20 ㎕) 최대 200 ㎍ 이상의 RNA 합성이 가능하다. 또한 필요 시 scale up이 가능하며, 200 ㎕ 반응에서도 mRNA 수율의 직선성 (수율 기대치)에 문제가 없음을 확인했다 (사용자 메뉴얼 참고).
Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)을 사용해 mRNA를 합성하는 경우 목적 유전자 (GOI) cloning 후 Poly(A) 서열 하류에 추가 서열 없이 제한효소로 절단하는 것이 중요하다. 따라서 mRNA 합성용 plasmid의 선형화에는 Hind III (Code 1060A)의 사용을 강력히 권장한다 (사용자 메뉴얼 참고).
용도
- IVT 용 template plamsid DNA 제작
- CleanCap® Reagent AG (TriLink BioTechnologies)를 사용한 IVT
- Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) 등의 Cap analog를 이용한 capped mRNA 합성
(※ARCA 사용 시 본 제품과 다른 template 서열이 필요하니 주의 바랍니다.)
- Long non-coding RNA 합성
- guide RNA 합성
- siRNA precursor 합성
- RT-qPCR용 RNA standard template 합성
- Hybridization을 위한 RNA probe 합성
내용
Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)
| Linearized Template Vector (50 ng/㎕) |
10 ㎕ |
FLuc Control Fragment (100 ng/㎕)*1 |
10 ㎕ |
5× In-Fusion Snap Assembly Master Mix |
20 ㎕ |
*1 FLuc Control Fragment의 서열 정보는 아래를 참고.
Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)
| 10× Transcription Buffer |
40 ㎕ |
10× ATP |
40 ㎕ |
10× CTP |
40 ㎕ |
10× GTP |
40 ㎕ |
10× UTP |
40 ㎕ |
10× Enzyme Mix |
40 ㎕ |
Nuclease-Free Water |
3 x 1 ㎖ |
DNase I |
80 ㎕ |
Lithium Chloride Precipitation Solution |
600 ㎕ |
Positive Control Template (FLuc) (0.5 ㎍/㎕) *2 |
10 ㎕ |
*2 T7 promoter, 5’-UTR, FLuc CDS, 3’-UTR, Poly(A) 로 구성, 상세한 서열 정보는 아래 ※서열 정보를 참고해 주세요.
주의사항
- Template DNA나 반응에 사용되는 tube, micro-pipette 등이 RNase에 오염되어 있는 경우 RNA의 수율이 저하되거나 fragmentation이 일어날 수 있습니다. 따라서 RNase free의 전용 tube 및 micro-pipette을 사용하고 일회용 장갑을 사용하여 RNase 오염을 주의 바랍니다.
- 10x Enzyme Mix는 과도한 vortexing을 피하시기 바랍니다.
- Lithium Chloride Precipitation Solution은 사용 전에 실온에서 융해 바랍니다. 융해 후 혼합한 이후에도 침전물이 남을 경우 37℃에서 용해시키고, 그래도 침전물이 남는 경우에는 그대로 사용해도 됩니다.
보존 -20℃
본 제품 이외에 필요 시약 (주요 시약)
- CleanCap® Reagent AG (TriLink Biotechnology)
- pseudo-UTP 등의 변형 nucleotide
- 제한효소 (Hind III)
※서열 정보
- FLuc Control Fragment
: sequence fasta 파일 바로가기
: Positive Control Template (FLuc)의 2,685~4,367 (1,683 bp)과 동일한 서열이다.
- Linearized Template Vector
: sequence fasta 파일 바로가기
: Vector map 바로가기
- Positive Control Template(FLuc)
: sequence fasta 파일 바로가기
: Vector map 바로가기
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