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IVT 적용에 최적, Type IIS 제한효소

BspQ I

-

제조사 제품코드 제품명 용량 가격
(부가세별도)		 비고 사용자매뉴얼
Takara
 1227A
 BspQ I
관련학술 구매하기 		500 U
 140,000원  1227A_DS.v2412Da.pdf
Takara
 1227B
 BspQ I
관련학술 구매하기 		2,500 U (1227A x 5)
 625,000원 

  • 제한효소 인식서열 일정 염기 바깥 DNA를 절단하는 Type IIS 제한효소 (Isochizomer)
  • 비대칭의 이중가닥 DNA서열 인식
  • Translation 효율을 높이기 위해 in vitro transcription시 PolyA 서열 이외에 불필요한 염기가 없는 주형 DNA를 제작할 때 활용
제품설명
BspQ I은 비대칭의 특정 이중가닥 DNA서열을 인식하여 일정 염기 바깥의 DNA를 절단하는 Type IIS 제한효소이다 (Isochizomer). in vitro transcription시, mRNA 합성을 위한 주형 plasmid에 BspQ I 인식서열을 추가한 후, BspQ I을 처리하면 PolyA 서열 이외에 불필요한 염기가 없는 mRNA를 합성할 수 있다.*1
*1 mRNA 합성을 위한 주형 DNA를 제작할 때 PolyA 서열 뒤에 추가 염기가 남는 경우 mRNA의 translation 효율이 저하되므로 염기가 남지 않도록 설계하는 것이 중요하다 (그림 1).


그림 1. Poly A 서열 뒤에 추가되는 여분의 염기 수에 따른 mRNA translation 효율 비교
 3 종류의 제한효소 (BamH I, Hind III, BspQ I)로 선형화된 IVT용 plasmid로 mRNA 합성 후 TransIT®-mRNA Transfection Reagent (Code MIR 2250)를 사용해 HEK293T 세포에 transfection 하였다. 그 결과, FLuc positive control과 비교해서 23개의 추가 염기가 남아있는 mRNA는 translation 효율이 크게 저하되었다.
반면에 5개 이하의 염기가 남은 경우 모두 비슷한 translation 효율을 나타냈지만, 여분의 염기가 적을수록 mRNA의 translation 효율이 더 높은 경향을 보였다. 추가 염기가 없을 때 translation 효율이 가장 높기에 mRNA 합성을 목적으로 하는 주형 제작 시 BspQ I과 같은 Type IIS 제한 효소의 사용을 권장한다.
※ Hind III제한효소를 사용해 3개 이하의 잔여 염기가 남는 경우, translation 효율이 소폭 감소 되었지만 여분 염기가 없는 경우와 큰 차이를 보이지는 않는다.
용도
mRNA 합성 (in vitro transcription)에 사용되는 주형 plasmid의 선형화
내용

BspQ I (10 U/㎕)

500 U

10x BspQ I Buffer*

1 ㎖
* 본 버퍼에는 BSA가 포함되어 있지 않다.
보존 -20℃
기원
Escherichia coli carrying the plasmid containing the gene for BspQ I
일반적인 반응 조건

BspQ I＊

1 μl

10× BspQ I Buffer

2 μl

기질 DNA

1 μg

Nuclease-free water

up to 20 μl
↓
50℃、1시간 incubation
＊BspQ I 은 마지막에 추가한다.
반응 온도
50℃*
*주의: 37℃에 반응 시 50℃보다 절단 효율이 30% 정도로 낮아진다.
Unit의 정의
1unit은 50℃, 50 μl 반응에서 1시간 동안 형광 표지된 프로브(fluorescence-labeled probes)10 pmol을 절단하는 효소의 양
주의사항
- 효소의 강한 교반은 삼가한다.
열 실활 조건
70℃, 20분
메틸화의 영향
dam methylation, dcm methylation및 CpG methylation의 영향을 받지 않는다.
Star 활성
장시간 (e.g. 4시간 이상) 반응할 때, star 활성이 생길 수 있다.
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*Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143A)에 포함된 IVT용 주형 plasmid는 BspQ I 제한효소의 인식서열이 포함되어 있지 않아 사용이 불가능하다. 이 제품을 사용할 경우에는 Hind III (Code 1060A)를 추천한다.

Keyword :
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