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Cloned

DNA Polymerase I (E. coli )

제조사	제품코드	제품명	용량	가격 (부가세별도)	비고	사용자매뉴얼
Takara	2130A	DNA Polymerase I (E. coli)	500 U	81,000원
Takara	2130B	DNA Polymerase I (E. coli)	2,500 U (2130A x 5)	364,500원

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제품설명

본 효소는 주형 및 primer (DNA, RNA 모두 가능)가 존재할 때 dNTP를 기질로 주형에 상보적인 DNA를 5’→3’ 방향으로 합성한다. 또한 단일 가닥에 특이적인 3’ →5’ exonuclease 활성(proofreading)과 이중 가닥에 특이적인 5’→3’ exonuclease 활성을 가지고 있다. 이중 5’→3’ exonuclease 활성을 사용해 nick translation을 통해 DNA에 labelling을 시킬 수 있다.

보존

-20℃

농도

5 U/㎕

형상

50 mM	Potassium phosphate (pH6.5)
1 mM	DTT
50%	Glycerol

첨부 buffer 구성 (10x)

500 mM	Tris-HCl (pH7.8)
100 mM	MgCl₂
1 mM	DTT

활성의 정의

37℃, pH7.4에서 Poly d(A or T)를 주형 및 primer로 사용할 때 30분간 모든 10nmol의 nucleotide를 산성의 침전물로(acid-insoluble products) 바꾸는 효소 활성을 1 U으로 한다.

활성 측정용 반응액 조성

67 mM	Potassium phosphate (pH7.4)
6.7 mM	MgCl₂
0.1 mM	DTT
20 μM	Poly d(A-T)
33 μM	dATP
33 μM	[³H]dTTP

사용상의 주의

- 본 효소는 희석에 의한 활성 저하가 일어나지는 않으나, 심하게 교반하면 실활할 수 있다.
- Endonuclease를 포함하고 있지 않으므로 단독으로는 nick translation 활성을 거의 보이지 않는다.
- DNA와 친화성이 강하기 때문에 과량을 사용하면 aggregation이 일어나 반응이 충분히 진행되지 않을 수 있다.

용도

- DNase I (Code 2270)과의 병용에 의한 nick translation
- Okayama-Berg법을 사용한 이중 가닥 DNA의 합성 반응 (DNA Polymerase I 0.3 ㎍은 약 2.5 U에 해당)

기원

Escherichia coli carrying the plasmid which encodes the gene of Pol I

촉매하는 반응

(1) 5'→ 3' DNA polymerase활성
주형 및 primer (DNA, RNA 모두 가능)가 존재할 때 dNTP를 기질로, 주형에 상보적인 DNA를 5'→3' 방향으로 합성한다.

Polymerase 활성에 의한 반응은 아래의 3종류가 있다
- Gap filling: 이중 가닥 DNA gap의 3'-OH 말단에 nucleotide를 부가하고 남은 외가닥 부분을 채운다.
- Nick translation: 이중 가닥 DNA nick 부분의 3'-OH 말단에 nucleotide를 부가하면서 동시에 5'-말단의 nucleotide를 exonucleolytic 반응으로 제거한다.
- Strand displacement: nick 부분의 3'-OH 말단에 nucleotide를 부가함으로써 5'말단의 사슬을 치환한다.

(2) 이중 가닥 특이적 5'→ 3'exonuclease 활성

손상된 nucleotide를 제거하거나 DNA/RNA hybrid의 RNA를 분해한다.

(3) 단일 가닥 특이적 3'→ 5'exonuclease 활성

PCR에서의 fidelity에 관여하는 활성, (2) 와는 다른 도메인에 존재한다.

일반적 성질

- 분자량: 약 109,000
- Subunit
1분자당 1개의 Zn²⁺을 가진 single polypeptide chain
- 최적 pH: pH 7.4
- 보조인자: Mg²⁺
- 안정성: 격렬한 교반 과정에서 불활성화된다.
- 최적의 염 농도: 100 mM KCl

활성의 정의

Poly d(A-T)를 주형 및 primer로 사용하여 37℃, pH7.4에서 30분간 모든 10 nmol의 nucleotide를 산불용성 침전물로 바꾸는 효소 활성을 1U으로 한다.

Keyword :

수식효소／DNA Polymerase、RNA Polymerase

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