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T4 RNA Ligase

제조사	제품코드	제품명	용량	가격 (부가세별도)	비고	사용자매뉴얼
Takara	2050A	T4 RNA Ligase	1,000 U	182,000원
Takara	2050B	T4 RNA Ligase	5,000 U (2050A x 5)	820,000원

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제품설명

본 효소는 ATP를 AMP와 PPi로 분해하여 그 에너지로 5’-P말단의 oligonucleotide와 3’-OH 말단의 oligonuceotide를 결합시키는 효소이다. 또한, 한 분자 내에서 혹은 두 분자 간에서의 ligation이 동시에 일어난다.
최소 기질은 NpNpNOH (3'-OH oligomer, 수용체), pNp (5', 3'DP monomer, 공여체)이며 ligation 효율은 수용체, 공여체 각각의 염기에 크게 영향을 받으며 일반적으로 수용체에는 purine을, 공여체는 pyrimidine을 포함할 때 효율이 좋다. 또한, DNA 에서는 RNA보다 훨씬 ligation 효율이 떨어지고, 구조적으로 3’말단에 가까운 P 말단을 갖는 RNA도 효율이 좋지 않으며, 3’- uridine oligomer 또한 수용체로써 부적당하다. 3’수용체의 경우는 BAP처리에 의하여 효율을 높일 수 있다.

보존

-20 ℃

농도

40 U/㎕

형상

20 mM	Tris-HCl (pH7.5)
50 mM	NaCl
1 mM	DTT
0.1 mM	EDTA
50%	Glycerol

첨부 buffer 구성(10x)

500 mM	Tris-HCl (pH7.5)
100 mM	MgCl₂
100 mM	DTT
10 mM	ATP
0.1%	BSA[별첨]*

*BSA가 침전될 수 있으므로 동결 융해는 가능한 한 피한다.

활성의 정의

Oligo(A)_n을 기질로 5℃, 10분에 1 pmol의 [5'- ³²P]pCp을 산 불용성 침전물로 사용하는 것을 효소활성 1 U로 한다 (RNA 3'말단 표지 반응).

활성측정용 반응액 조성

50 mM	HEPES-NaOH 완충용액 (pH7.5)
20 mM	MgCl₂
3.3 mM	DTT
6 μM	ATP
0.001%	소혈청 알부민
10%	DMSO
1.2 μM	3’-OH RNA
2.4 μM	[5'- ³²P]pCp

순도

- 100 U의 본 효소와 1 ㎍의 λDNA-Hind III 분해물을 37℃, 24시간 반응해도 DNA의 전기영동 패턴에 변화가 없다.
- 100 U의 본 효소와 1 ㎍의 16S와 23S rRNA를 37℃, 24시간 반응하여도 RNA의 전기영동 패턴에 변화가 없다.
- 20 U의 본 효소와 6 ㎍의 λDNA-Hind III 분해물 또는 6 ㎍의 λDNA-Pst I 분해물을 37℃, 24시간 반응하여도 각 DNA는 T4 DNA ligase에 의해 90% 이상 연결되고, 그중 100%가 각각 Hind III 또는 Pst I에 의해 재절단된다.

사용상의 주의

-Ligation의 최적반응 온도는 5~15℃로 그 이상의 온도에서는 반응이 억제된다.
-PEG 존재 하에서 반응이 촉진되지만 반응 특이성에서 변화는 없다.
-10x 첨부 buffer에 0.1% BSA를 직접 첨가하면 다량의 백색 침전이 생기므로 반응물 조제 시 다음 순서로 시약을 첨가한다.
: 멸균정제수-> 10X buffer-> 0.1% BSA-> 기질 RNA or DNA

용도

-단일가닥의 RNA 및 DNA의 3’-OH말단 표지
-oligo RNA 혹은 단일가닥 oligo DNA의 연결
-완전한 길이의 cDNA 합성

기원

Escherichia coli carrying the plasmid encoding T4 RNA ligase gene

일반적 성질

-분자량, 약 47,000
-소단위, single polypeptide
-최적 pH, pH7.2~8.4 (분자간 반응 시) HEPES-NaOH Buffer<

수용체가 DNA 올리고머의 경우	pH8.3 (ATP생성계 없음)
	pH7.9 (ATP생성계 있음)

-보조인자
  ATP (필수적으로 사용, 1mM 이상에서 억제반응, ATP:공여체=3:1 정도가 좋다)
  dATP 사용시 20%만의 효율을 보인다. (다른 NTP 대용 불가)
-활성화제
  2가 양이온: Mg²⁺ (최적농도: 20mM)
  수용체가 DNA인 경우 ATP 재생성에 필요한 Mn²⁺가 유리하다.
-DMSO
  10~20% (40% DMSO에서도 활성이 남아있다.)
  10% DMSO는 pCp을 이용한 RNA 말단의 표식에서 2~3배 활성화 효과가 있다.
  DNA올리고머의 pdNp의 부과 효과에는 영향이 없지만, 10% DMSO에서 한 가닥 DNA 올리고머의 연결이 촉진된다.
-무기염화헥사아민코발트 (HCC)
  환원제
- DTT (1~20 mM, 33mM DTT에서도 저해되지 않는다.)
  저해제
-PPi, Pi, NH₄⁺(기질의 염을 제거하면 효율이 증가하는 경우가 있다.)

참고

Yeast tRNA^phe를 기질로 했을 때, 상기의 반응액에서 50 U의 본 효소를 5℃에서 16시간 처리하면 80% 이상의 tRNA^phe에 3'말단이 표시된다.

Keyword :

수식효소／Ligase

Cloned

E. coli DNA Ligase

Cloning용 ligase

T4 DNA Ligase

T4 RNA Ligase