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Cell과 배양 배지에서 AAV 추출부터 정제까지

Cell & Sup. Purification Kit

-

제조사 제품코드 제품명 용량 가격
(부가세별도)		 비고 사용자매뉴얼
Takara
 6676
 AAVpro® Cell & Sup. Purification Kit Maxi (All Serotypes)
관련학술 구매하기 		4회
(Package) 		1,382,000원  6676-6678_e.v2108Da.pdf
Takara
 6677
 AAVpro® Cell & Sup. Extraction/Concentration Pack Maxi (All Serotypes)
관련학술 구매하기 		1 Kit
(Package) 		810,000원  6676-6678_e.v2108Da.pdf
Takara
 6678
 AAVpro® Purification Pack Maxi (All Serotypes)
관련학술 구매하기 		4회
(Package) 		725,000원  6676-6678_e.v2108Da.pdf

  • AAV packaging cell과 배양 상등액 모두에서 AAV 정제
  • 다양한 serotype의 AAV 정제에 적용 가능
  • 높은 수준의 AAV recovery와 정제 효율
  • 독자적으로 개발한 초 간단 AAV 추출 방식 채택
    : Ultracentrifugation 혹은 freeze-thaw와 같은 복잡한 방법 불필요
  • All-in-one kit : AAV 정제에 필요한 모든 구성 포함
제품 설명
Adeno-Associated Virus (AAV)는 분열, 비분열 세포에 유전자 도입이 가능하며, 특히 비분열 세포에서는 장기간 유전자 발현이 가능하다. 또한, 면역원성 (immune response)이 낮아 in-vivo 실험에 최적이다. 이러한 AAV를 실험 동물에 도입할 때에는, packaging cell과 배양 배지로부터 유래한 불순물들을 제거해야 한다.

AAV 정제에는 일반적으로 CsCl2/iodixanol gradient ultracentrifugation 법을 사용하지만 고도의 숙련된 기술을 필요로 하며, 회수율이 낮고, 시간이 오래 소요되는 단점이 있다.

AAVpro® Cell & Sup. Purification Kit Maxi (All Serotypes) (Code 6676)은 T225 flask 5개 (1회 당)에서 배양한 AAV packaging cell과 배양 상등액에서 다양한 serotype의 AAV를 쉽게 정제할 수 있으며, 약 7시간이 소요된다. AAV 추출 과정은 독자적으로 개발한 매우 간단한 방식을 이용하고 있으며, ultracentrifugation 혹은 freeze-thaw와 같은 복잡한 방법을 필요로 하지 않는다
AAV 추출 및 정제 workflow
제품 성능 확인
1) AAV의 정제 및 순도 측정
ZsGreen1 형광단백질을 발현하는 각 serotype의 AAV (AAV1, AAV2, AAV5, AAV6)를 packaging 했으며, AAVpro® Cell & Sup. Purification Kit Maxi (All Serotypes) (Code 6676)을 이용해 총 5개의 T225 flask에서 배양된 packaging cell과 배양 상등액으로부터 AAV를 추출 및 정제하였다. 이렇게 정제한 AAV를 AAVpro® Titration Kit (for Real Time PCR) (Code 6233)로 역가를 측정하여, 1X109 vg/lane 으로 SDS-PAGE를 수행하였다.
그 결과, 각 serotype 별 모든 AAV에서 AAV capsid protein인 VP1, VP2, VP3 band를 확인하였다.


2) 정제된 AAV의 감염 효율 비교
1)에서 정제한 serotype 별 AAV를 293T cell과 HeLa cell에 각각 transduction 한 후 감염 효율을 평가하였다. 정제한 AAV를 각 세포에 50,000 vg/cell 로 감염시킨 3일 후 flow cytometry로 분석한 결과, 본 제품을 이용해 정제한 후에도 감염 능력을 유지하고 있음을 확인하였다.


3) 기존 제품과의 정제 효율 비교
다양한 serotype의 AAV에서 AAVpro® Cell & Sup. Purification Kit Maxi (All Serotypes) (Code 6676)을 사용해 정제한 양을 100%로 했을 때 기존 제품인 AAVpro® Purification Kit Maxi (All Serotypes) (Code 6666)으로 정제한 AAV의 양을 비교하였다. AAV는 serotype이나 유전자에 따라 세포 밖의 배지에도 많은 양이 존재하는 경우가 확인된다. 이 제품을 사용하면 세포 밖의 배지에 존재하는 AAV까지 회수해, 세포 안의 AAV만을 정제하는 제품에 비해 더욱 고수율로 AAV를 정제할 수 있다.
내용
AAVpro® Cell & Sup. Purification Kit Maxi (All Serotypes) (Code 6676)
- AAVpro® Cell & Sup. Extraction/Concentration Pack Maxi (All Serotypes) (Code 6677)
- AAVpro® Purification Pack Maxi (All Serotypes) (Code 6678)

AAVpro® Cell & Sup. Extraction/Concentration Pack Maxi (All Serotypes) (Code 6677)
- AAV Extraction Solution C

8 ㎖

- AAV Extraction Solution D

32 ㎖

- AAV Extraction enhancer

80 ㎖

- Concentrating Solution*1

115 ㎖ X 2

- Dissolving Solution

50 ㎖
*1 Concentrating Solution를 4°C에서 보관했을 때 침전물이 발생할 수 있으나, 이는 시약의 품질이나 성능에 영향을 미치지 않는다. 만일 침전물이 발생한 경우, 40°C에서 완전히 녹인 후 사용한다.

AAVpro® Purification Pack Maxi (All Serotypes) (Code 6678)
- Precipitator A*2

5 ㎖

- Precipitator B

2.5 ㎖

- Millex-HV 0.45 ㎛

4 pcs

- Amicon Ultra-15, 100 kDa

4 pcs

- Suspension Buffer

60 ㎖ X 2

- Cryonase Cold-active Nuclease

500 ㎕
*2 Precipitator A를 낮은 온도에서 보관했을 때 침전물이 발생할 수 있으나, 이는 시약의 품질이나 성능에 영향을 미치지 않는다. 만일 침전물이 발생한 경우, 37°C에서 완전히 녹인 후 사용한다.
관련제품

Keyword : AAV,Adeno-associated virus,extract,extraction,추출,purification,정제,concentration,농축,transduction,감염,in-vivo,in vivo,invivo,인비보,동물실험,실험동물,면역원성
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