- Tat-independent한 3세대 lentivirus packaging system- HIV-1 유래 서열을 최대한 제거하여 안전성을 향상, 임상 연구에 최적
- 5’ LTR U3 부위가 CMV promoter로 대체되어, tat trans-activator 없이도 virus 생산 가능
- 3’ LTR 일부 결손으로 self-inactivation (SIN) 되어, 바이러스 자가 복제 방지
- 고역가 lentivirus 생산을 위해 최적화된 패키징 프로토콜
- 실험에 따른 다양한 expression vector 선택
- 목적 유전자에 따른 최적의 promoter 선택 가능
(1) Promoter 선택 (MSCV, MSCV-EI, EF1α)
(2) 형광 단백질 유무 선택 (ZsGreen1)
(3) Kanamycin 내성 유전자 선택 (pLVpro2-Km) ; 임상 개발에서 적용 가능
※ 본 제품은 Cloning을 위해 In-Fusion
® 시약을 함께 사용할 수 있으며, 원활한 결과를 얻기 위해
제품 사용 전 In-Fusion® 원리(동영상링크)를 반드시 참고해주시기 바랍니다.
제품 설명
LVpro Packaging Mix는 여러 개의 packaging plasmid (env, gag, pol, rev 발현)를 premix 형태로 제공하며, 연구자가 실험 조건 최적화 및 셋팅 과정을 거치지 않고도 높은 역가의 lentivirus를 생산할 수 있다. 본 제품은 HIV-1 유래의 tat 서열을 제거하고 5’ LTR의 U3 부위는 CMV promoter로 대체하여 tat-independent한 lentivirus를 생산할 수 있다. 3세대 Lentiviral vector인 pLVpro vector plasmid와 함께 packaging cell에 co-transfection하여 생산된 바이러스는 HIV-1 유래의 Gag, Pol, Rev 단백질과 VSV-G envelope을 일시적으로 발현한다.
임상 적용을 위한 lentivirus 생산을 위해, kanamycin 내성 유전자를 갖는 plasmid (pLVpro2-Km) 라인업을 제공한다. 또한, pLVpro2-Km 시리즈는 HIV-1 유래 서열을 더욱 최소화하여 기존 pLVpro 제품보다 안전성이 향상되었다.
pLVpro vector plasmid로부터 전사된 재조합 바이러스 RNA는 완전한 viral particle로 만들어지며 (Figure 1), 바이러스 제작을 위한 transfection 시에는 보다 높은 역가의 바이러스를 생산하도록 구축된 Lenti-X™ 293T Cell Line (Code 632180)과 functional한 바이러스 생산 효율을 높여주는 TransIT®-VirusGEN™ Transfection Reagent (Code MIR 6700)을 추천한다.
그림 1. LVpro Packaging Mix 와 Lenti-X 293T 세포를 이용한 Lentivirus 생산 workflow
타겟 유전자를 포함하는 pLVpro lentiviral vector plasmid와 LVpro Packaging Mix를 co-transfection하면 (Step 1), 재조합 lentiviral genomic RNA 전사체와 바이러스 패키징 단백질이 생성된다 (Step 2). 재조합 viral RNA genomic의 패키징 서열 (Ψ)이 패키징 단백질에 의해 인식되면 (Step 3), 재조합 viral RNA genome이 패키징 단백질과 통합되어 viral core를 형성하고, 이 형성된 core는 세포막으로 이동한다 (Step 4). 이 core는 VSV-G envelope 단백질을 포함하는 세포막으로 감싸지며, 성숙하고 감염성 있는 virions (바이러스 입자)가 세포에서 배양배지로 방출된다 (Step 5). 그 후 바이러스 입자는 배양 배지에서 회수한다 (Step 6). 회수된 바이러스 입자는 감염성은 가지지만, 표적 세포에서의 자가 복제나 증식에 필요한 여러 유전자가 결핍되어 있다. 또한 바이러스 단백질 발현에 여러 개로 나누어진 플라스미드가 사용되기 때문에, 복제 가능한 바이러스를 생성하기 어렵고 매우 안전한 바이러스만을 생산할 수 있게 된다.
표1. 타사 packaging system과의 생산 효율 비교를 위한 실험 디자인
* Company A’s vector는 CMV promoter 하류에서 ZsGreen1 발현
그림2. LVpro Packaging Mix (Code 6195)와 타사 제품 간의 바이러스 생산 효율 비교
HT-1080 세포에서 테스트한 결과, 타사의 packaging 시스템을 이용한 1번 실험 군 대비 당사 packaging 시스템을 사용한 4번 실험 군이 10배 이상의 높은 생산 효율을 보였다.
Expression vector 구조
- SIN 5‘LTR: CMV promoter hybrid 5’ LTR (U3 free, tat independent)
- Lentivirus packaging signal (Ψ)
- Minimal gag sequence
- RRE (Rev response element)
- cPPT/CTS (central polypurine tract/central termination sequence)
- GOI 발현 promoter
Option 1) MSCV promoter: 목적 유전자가 크거나, 안정적인 바이러스 생산 역가가 요구될 때
Option 2) MSCV-EI promoter: 크기가 큰 목적 유전자의 과발현을 유도하고자 할 때
(Human EF1α 유전자 유래의 exon, intron 서열을 MSCV-U3 promoter 하류에서 발현)
(단, 목적 유전자의 크기와 서열에 따라, MSCV promoter에 비해 생산 역가가 낮을 수 있음)
Option 3) EF1α promoter: 목적 유전자의 과발현을 유도하고자 할 때
- WPRE (woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element): X protein이 낮게 발현하도록 개량되어, transduction된 목적 세포에서의 tumorigenesis 유발 확률 감소
- SIN 3‘LTR (U3 free)
Vector 서열 (vector명 클릭 시 .fasta data 다운 가능)
벡터명 |
Code |
길이 |
pLVpro-MSCV Vector |
6962 구성품 |
6,208 bp |
pLVpro-MSCV-ZsGreen1 Vector |
6965 구성품 |
6,916 bp |
pLVpro-MSCV-EI Vector |
6963 구성품 |
7,184 bp |
pLVpro-MSCV-EF1-ZsGreen1 Vector |
6966 구성품 |
7,892 bp |
pLVpro-EF1α Vector |
6964 구성품 |
7,032 bp |
pLVpro-EF1α -ZsGreen1 Vector |
6967 구성품 |
7,740bp |
pLVpro2-Promoterless-Km |
6977 |
5,635 bp |
pLVpro2-MND-Km |
6978 |
6,069 bp |
pLVpro2-EF1α-Km |
6979 |
6,823 bp |
pLVpro2-EFS-Km |
6980 |
5,871 bp |
pLVpro2-MSCV-Km |
6981 |
5,999bp |
보관 : - 20 ℃
관련제품
- Functional한 바이러스를 더 많이 생산하는 transfection 시약: TransIT-VirusGEN® Transfection Reagent (Code MIR 6700)
- 고효율 Lentivirus packaging cell line: Lenti-X™ 293T Cell Line(Code 632180)
- 바이러스 농도가 낮을 때, 농축 시약: Lenti-X™ Concentrator (Code 631231)
- ELISA법으로 간단하게 lentivirus 역가 측정: Lenti-X™ p24 Rapid Titer Kit (Single Wash) (Code 631476)
- 다양한 cell-line에 편리하게 transduction: Lenti-X™ Transduction Sponge (Code 631478)
