- TCR repertoire profiling : 5' RACE법을 접목시켜 TCR-α , TCR-β chain의 full-length V(D)J variable region 서열을 분석할 수 있다. V(D)J 서열 분석 시 Miseq 추천하며, CDR3 서열 분석 시 모든 Illumina® 기기에 적용이 가능하다.
- Unique Dual Index kit (별매)와 호환 : 목적에 따라 multiplexing이 가능하며, 최대 384개의 샘플을 한번에 분석할 수 있다. UDI를 적용하여 high-throughput 기기에서 index hopping을 낮출 수 있다. (예: NovaSeq™ 적용 가능)
- 다양한 input range : PBMCs의 high-integrity RNA (10 ng-1 ㎍), T cells total RNA (1-100 ng), whole T cell (1,000 - 10,000 purified cells), whole blood total RNA (20-200 ng)
- 높은 정확도 : UMIs 기반으로 PCR duplicates, errors 보정
- End-to-end solution : Cogent NGS Immune Profiler Software 로 sequencing data를 분석하고 Cogent NGS Immune Viewer 로 결과 data를 visualization
제품설명
SMART-Seq® Human TCR (with UMIs)은 5’ RACE기술 (Rapid Amplification of cDNA Ends)과 NGS 분석 기법을 조합한 제품으로, RNA 샘플로부터 아주 민감하고 정확한 TCR profiling을 위한 최적화된 시스템을 제공한다.
SMART (Switching Mechanismat 5' end of RNA Template) full-length cDNA합성기술을 5’RACE법과 접목시켜 human TRA와 TRB 유전자의 V(D)J variable region을 완전하게 캡처한다. TCR-α, TCR-β chain을 동시에 또는 각각의 chain에 대한 NGS library를 제작하여 분석할 수 있다.
본 제품을 이용하면 RNA 샘플 (RIN값 8 이상)로부터 고품질의 library를 제작할 수 있으며, peripheral blood leukocytes (10 ng - 1 ㎍), T cell 유래 total RNA (1 - 100 ng), whole T cell (1,000 - 10,000 purified cells)에 적용할 수 있다.
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샘플
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샘플량
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PBMC 유래 total RNA
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10 ng - 1 ㎍
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T-cell 유래 total RNA
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1 - 100 ng
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전혈 유래 total RNA
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20 - 200 ng
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T-cell
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1,000 - 10,000 cells
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제품 내에는 Unique Molecular Identifiers (UMIs)를 포함하고 있어, PCR 혹은 sequencing error로부터 유래한 reads를 제거한 후 분석함으로써 보다 정확하고 신뢰도 있는 결과를 얻을 수 있다. 또한 최대 384개의 multiplex Illumina library prep이 가능한 UDI (Unique Dual Index Kit : 별도 판매)를 사용하기에 index hoping으로 인한 다른 library 샘플 유래의reads 오염을 방지할 수 있다.
Sequencing 후, UMI-based error correction을 위해 Cogent NGS Immune Profiler Software 또는 Cogent NGS Immune Viewer 를 이용하여 데이터를 분석할 수 있다. 본 소프트웨어는 clonotype count, 동정 및 V(D)J 영역의 서열 분석 등을 포함한 고품질의 TCR profiling 분석툴을 제공한다.
그림 1. SMART-Seq® Human TCR (with UMIs)을 이용한 library prep workflow
SMARTScribe Reverse Transcriptase를 이용하여 1st strand cDNA를 합성하며 mRNA 5'말단에 이르면 template에서 유래하지 않은 nucleotide (3'-XXXX-5')가 부가된다. 이렇게 부가된 non-templated nucleotide에 SMART UMI Oligonucleotide가 결합하고, 이후 역전사 반응에 의해 SMART UMI Oligonucleotide 서열에 상보적인 nucleotide가 추가로 합성된다 (Template-switching step). 이 과정에서 합성된 1st strand cDNA는 두 단계의 gene specific PCR amplification 과정 (Nested PCR)을 거치게 된다. Nested PCR을 거친 PCR 산물은 대부분의 reads가 TCR 전사체에 mapping된다.
그림 2. 다양한 RNA input 양에서 높은 감도 및 재현성으로 clonotype 검출
TRA, TRB library는 1, 10, 100 ng의 human CD3+ T cell total RNA와 1,000 CD3+ T cells, 10,000 CD3+ T cells로부터 제작하였다. 얻어진 sequence reads는 Cogent NGS Immune Profiler Software로 분석하였다.
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% Jurkat RNA spiked in to 100 ng of PBMC RNA
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Total read count (TRA/TRB)
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Without UMI collapse
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With UMI collapse
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# of TRB raw reads
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# of reads for TRBV12-3-TRBJ1-2
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Detected percentage of Jurkat reads
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# of detected UMIs
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# of UMIs for TRBV12-3-TRBJ1-2
|
Detected percentage of Jurkat UMIs
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10.0%
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2,500,000
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1,565,005
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397,179
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25.0%
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281,280
|
62,629
|
22.0%
|
|
1.0%
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2,500,000
|
1,422,102
|
47,160
|
3.3%
|
219,776
|
6,426
|
2.9%
|
|
0.1%
|
2,500,000
|
1,366,127
|
5,412
|
0.4%
|
189,580
|
631
|
0.33%
|
|
0.01%
|
2,500,000
|
1,218,025
|
521
|
0.043%
|
196,615
|
74
|
0.038%
|
|
0.001%
|
2,500,000
|
1,331,465
|
909
|
0.068%
|
197,870
|
6
|
0.003%
|
|
0.0001%
|
2,500,000
|
1,409,199
|
-
|
0%
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124,149
|
-
|
0%
|
|
0%
|
2,500,000
|
1,222,245
|
-
|
0%
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197,933
|
-
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0%
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표 1. SMARTer® Human TCR a/b Profiling Kit v2 (TCRv2)의 감도와 재현성 평가
Leukemic Jurkat T cells (containing TRBV12-3-TRBJ1-2 clonotypes)의 homogeneous population 으로부터 얻은 RNA를 다양한 농도 (10%, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 0.0001%)로 spike한 PBMC RNA샘플에 대해 반복적인 분석을 하였다. 100 ng total RNA로부터 TRB CDR3 영역을 증폭하고, Illumina NextSeq® 시스템으로 2 x 150 bp의 reads를 얻었다. Sequencing reads는 2.5M reads로 downsampling되었다. UMI에 의한 data를 보정하지 않은 경우 (Without UMI collapse)와 UMI에 의해 data 보정을 했을 경우 (With UMI collapse) spike-in RNA 농도의 검출 한계를 음영 (gray)으로 나타내고 있다. UMI에 의한 data 보정이 없는 경우, TRBV12-3의 검출 한계는 0.01%였지만, UMI에 의해 data를 보정할 경우에는 0.001%까지 검출할 수 있었다.
그림 3. 타사 제품과의 비교
두 종류 검체의 PBMC에서 total RNA와 gDNA를 정제한 후, 1.6 ㎍ gDNA (Y사)와 100 ng RNA (X사)의 library를 제작하였다. 각 제품을 사용하여 얻은 TCR α/β library의 clonotype 수를 비교한 결과, 당사 kit는 TRA를 평균 48.7K, TRB를 163K 얻을 수 있었고, 타사대비 더 많은 clonetype을 검출할 수 있었다 (NT: not tested).
구성품 (자세한 내용은 CoA를 참조하세요)
Box 1:
- Control RNA ※ (1 ㎍/㎕)
- TCR SMART UMI Oligo (48 μM)
Box 2:
- 10X Lysis Buffer
- 5X Ultra Low First-Strand Buffer
- TCR dT Primer (12 μM)
- SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/㎕)
- RNase Inhibitor (40 U/㎕)
- Elution Buffer (10 mM)
- Nuclease-Free Water
- PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/㎕)
- 5X PrimeSTAR GXL Buffer
- dNTP Mix (2.5 mM each)
- hTCR PCR1 Universal Forward (12 μM)
- hTCRa PCR1 Reverse (12 μM)
- hTCRb PCR1 Reverse (12 μM)
- hTCRa PCR2 UDI Reverse (12 μM)
- hTCRb PCR2 UDI Reverse (12 μM)
※ Control RNA is human spleen Total RNA.
보존
Box 1: -70℃
그 외: -20℃ (융해 후에는Box 2의 10X Lysis Buffer는 4℃ 보관, Elution Buffer는 실온 보관)
관련 제품
- Multiplexed sequencing library 제작을 위한 Unique Dual Index Kit (Code 634756 외)
- Complete BCR repertoire profiling SMART-Seq® Human BCR (with UMIs) (Code 634777 외)
- 정확도 높은PCR 반응을 위한 2X premix PrimeSTAR® GXL Premix (Code R051A 외)
- DNA purification & size selection을 위한 SMARTer®-Seq™ Magnetic Separator-PCR Strip (Code 635011)
Citation
‘SMARTer® Human TCR a/b Profiling Kit v2’ 제품은 ‘SMART-Seq® Human TCR (with UMIs)’으로 제품명이 변경되었습니다 (자세한 내용은 제품페이지를 참조). Citation이 동일합니다.
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