• Picogram 수준의 극소량 샘플 적용: 250pg - 10ng total RNA (Human, mouse, rat)
• FFPE, LCM 샘플에서 추출한 RNA 또는 Cell-free RNA 등의 분해된 RNA 샘플 적용 가능
• Improved sequencing performance: PhiX control을 추가하지 않아도 높은 수준의 cluster passing filter (%PF)를 얻을 수 있음
• Fast, streamlined protocol: 6시간 이내 Illumina^® NGS Library 제작 가능
• PCR 버퍼의 조성을 변형하여 Library 정제 효율 향상

제품설명

SMARTer^® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian 은 250pg-10ng 수준의 Human, mouse, rat total RNA로부터 Strand-specific Illumina^® NGS library를 효율적으로 제작할 수 있다. 본 제품은 극미량의 total RNA를 이용할 수 있을 뿐만 아니라 FFPE, LCM 샘플과 같이 RNA integrity가 현저히 낮은 샘플에서도 NGS Library를 제작 가능하다. 기존의 Version 1 제품에 비하여 Version 2 제품은 Illumina^® Sequencing의 효율을 보다 향상시켰으며, 역전사 반응과 PCR 증폭 과정에서 Illumina^® index와 adaptor를 부가하여 6시간 이내에 strand-specific RNA-Seq library를 제작 가능하다.

Ribosomal RNA (rRNA)는 total RNA의 약 90%를 차지하는 RNA로써 NGS library 제작 전, rRNA를 제거(depletion)함으로써 제작비용을 절감할 수 있을 뿐만 아니라 mapping statistics 또한 향상시킬 수 있다. 하지만 매우 극소량의 Total RNA를 이용할 경우 일반적인 방법의 rRNA depletion은 NGS library 제조하는 데 필요한 양에 미치지 못 하게 된다. 본 제품에 사용된 기술은 mammalian rRNA와 mitochondrial RNA 특이적인 Probe를 이용하여 rRNA derived cDNA를 제거하여 보다 높은 mapping statistics를 얻을 수 있다.

SMARTer^® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian은 two channel SBS 기술을 적용한 Illumina^® NextSeq, MiniSeq, HiSeq 3000/4000을 이용하는 경우에도 PhiX Control Spike-in RNA의 첨가 없이 높은 비율의 Cluster passing filter (%PF)를 얻을 수 있다. 이는 1회 Running당, 보다 생물학적으로 의미있는 sequencing reads를 얻을 수 있으므로 전체적으로 sequencing cost를 줄일 수 있다. 또한 본 제품은 기존 제품에 비하여 새로운 PCR Buffer를 이용하므로 보다 높은 NGS Library 정제 효율을 기대할 수 있다.

본 제품은 12, 48, 96, 192회 제품으로 제공되며, High-throughput 제품인 96회와 192회 제품 내에는 12개의 reverse primer와 8개의 forward primer가 포함되어 있어 최대 96개의 illumina^® index 조합이 가능하다. Library 제작과 정제를 포함한 NGS Library 전체 제작은 6시간 이내에 완료할 수 있다.

Alternate kits for other input amounts:

• For 10-100 ng total RNA, we recommend the SMARTer Stranded Total RNA Sample Prep Kit - Low Input Mammalian (Code 634861)
• For 100 ng-1 μg total RNA, we recommend the SMARTer Stranded Total RNA Sample Prep Kit - HI Mammalian (Code 634873)

그림 1. Schematic of technology in the SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian (내용 자세히보기)


그림 2. SMARTer^® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian을 이용하여 제작한 NGS Library의 구조.
The adapters added using 5' PCR Primer HT and 3' PCR Primer HT contain sequences allowing clustering on any Illumina flow cell (P7 shown in light blue, P5 shown in red), Illumina TruSeq^® HT indexes (Index 1 [i5] sequence shown in yellow, and Index 2 [i7] sequence shown in orange), as well as the regions recognized by sequencing primers Read Primer 2 (Read 2, purple) and Read Primer 1 (Read 1, green). Read 1 generates sequences antisense to the original RNA, while Read 2 yields sequences sense to the original RNA (orientation of original RNA denoted by 5' and 3' in dark blue). The first three nucleotides of the second sequencing read (Read 2) are derived from the Pico v2 SMART Adapter (shown as Xs). These three nucleotides must be trimmed prior to mapping if performing paired-end sequencing.


그림 3. Cluster passing filter rate (%PF) 향상
Libraries generated with the Pico v1 or Pico v2 kits were pooled and run on NextSeq 500 or MiniSeq instruments, as indicated. For each graph, blue boxplots indicate the distribution of cluster densities for unfiltered (i.e., raw) reads, while the green boxplots indicate the distribution of cluster densities for reads that passed filtering. Quantities of reads passing filter (in millions) and %PF values for each sequencing run are included above each graph. The expected number of reads passing filter according to Illumina specifications was 130 million reads for runs on the NextSeq and 25 million reads for runs on the MiniSeq. Proportions of reads that aligned to PhiX sequences ranged from 0.5% to 1.15% for all sequencing runs. As indicated in the graphs, libraries generated with the Pico v2 kit achieved higher %PF values for both Illumina platforms relative to libraries generated with the Pico v1 kit, and yielded quantities of reads passing filter that greatly exceeded the Illumina specifications.


그림 4. Version 1 제품과 비교하여 높아진 Sequencing sensitivity와 Reproducibility
Sequencing libraries were generated from 1 ng and 10 ng inputs of total RNA extracted from human lung FFPE tissue using both the Pico v1 and Pico v2 kits, and sequenced on a NextSeq 500 instrument. Panel A. Sequencing metrics for libraries generated from 1 ng or 10 ng inputs using each kit. For both input amounts, the Pico v2 kit resulted in greater library yields, a lower proportion of reads mapping to rRNA and mtRNA, and a lower duplicate rate. For the 1 ng input, sequencing data from the Pico v2 library also identified thousands more transcripts than sequencing data from the Pico v1 library, indicating a higher sensitivity for Pico v2. Panel B. Comparison of transcript expression levels across input amounts. Higher reproducibility was observed between 1 ng and 10 ng inputs for data generated with the Pico v2 kit vs. data generated using the Pico v1 kit. FPKM values are shown on a Log10 scale. Transcripts represented in only one library can be seen along the X- and Y-axes of the scatter plots.

적용

구성품 (자세한 구성품은 CoA 또는 매뉴얼 참조)