• NGS library 제작 전 FFPE 샘플의 품질 확인 가능
• 소량 (ng 수준)의 샘플로 DNA 품질 확인 가능 (전기영동법의 경우 100 ng 이상 필요)
• DNA의 정량 및 단편화 정도 확인에 필요한 시약이 모두 포함된 all-in-one kit
• 핵산 손상 등 FFPE 샘플의 품질 확인이 필요한 실험자에게 추천
• Human genomic DNA에 적용 가능
• NGS용 library prep kit (ThruPLEX^® 등)에 적합한 DNA input 양 및 PCR cycle 수 결정

제품 설명

FFPE (Formalin Fixed Paraffin Embedded) 샘플은 장기 보존이 가능하기 때문에 기초 연구뿐만 아니라 임상 분야에서 생체 시료 보존법으로 널리 활용되고 있다. 그러나 FFPE 샘플을 제작하는 과정에서 사용되는 포르말린은 DNA 분해 원인 중 하나로, DNA의 분해된 정도가 균일하지 않아 NGS 분석 시 데이터 품질에 큰 영향을 미친다. 따라서, FFPE 샘플의 품질을 NGS library 제작 전에 평가하는 것이 NGS 분석 성공의 중요한 요인이 될 수 있다.
Takara FFPE DNA QC All-in-One Kit는 NGS library 제작 전에 Real Time PCR (qPCR)법으로 FFPE 유래 DNA의 정량 및 품질 평가를 위한 제품이다. 본 제품은 사람의 housekeeping 유전자 상에서 길고 짧은 두 개의 amplicon용 프라이머를 설계하였으며, 각 amplicon (Long Assay: 268 bp, Short Assay: 92 bp)의 qPCR 증폭을 통해 FFPE 시료 내에 PCR 증폭이 가능한 유효분자 (effective molecule) 수를 정량하고 품질 평가를 실시하도록 하였다. NGS library 제작 전에 DNA의 정량 및 품질을 평가하여, 이후 진행되는 library 제작에 필요한 DNA input 양과 증폭 cycle 수의 기준을 결정할 수 있어 library 제작의 성공률을 향상시킬 수 있다.
본 제품은 qPCR용 premix, primer/probe mix (FAM), DNA standard 등 평가에 필요한 시약이 모두 포함된 all-in-one kit이다.


그림 1. Takara FFPE DNA QC All-in-One Kit의 정량 및 품질 평가 방법
유효 분자 (effective molecule) 수 정량:
Serial dilution한 standard DNA를 이용하여 qPCR을 실시하고, 산출된 Ct값을 y축으로, standard DNA copy 수의 로그 값을 x축으로 standard curve를 그린다. 이 검량선을 이용하여 타겟 샘플의 Short Assay amplicon 증폭으로부터 유효 분자 수를 정량한다.

단편화 정도 확인:
단편화가 많이 진행된 FFPE 유래 DNA는 Long Assay amplicon의 증폭이 감소하게 된다. 따라서, Long/Short amplicon의 증폭 비율을 아래의 공식으로 구하여 FFPE 유래 DNA의 단편화 정도를 확인할 수 있다.
Long/Short ratio = Long Assay의 정량값/Short Assay의 정량값
(Long/Short ratio는 0~1의 범위에서 나오며, 단편화되지 않은 샘플의 Long/Short ratio 값은 1.0이며, 단편화가 진행됨에 따라 그 값은 0에 가까워진다.)

Takara FFPE DNA QC All-in-One Kit 적용 데이터

그림 2. 다양한 크기로 단편화된 DNA 샘플의 qPCR을 통한 품질 평가
Sonicator를 이용하여 단편화시킨 genome DNA의 단편화 정도를 전기영동으로 확인하였다 (Lane 2~7). 단편화된 DNA 샘플을 주형으로 Takara FFPE DNA QC All-in-One Kit를 이용하여 단편화 정도를 확인하였다. 단편화되지 않은 DNA의 Long/Short ratio는 1에 가까운 값을 나타내며, 단편화가 많이 된 샘플일수록 Long/Short ratio의 값이 0에 가까워지는 것을 확인하였다.


그림 3. FFPE 유래 DNA 품질 확인 qPCR 결과
(A) 5가지 FFPE 유래 DNA의 단편화 정도를 전기영동으로 확인하였고, Takara FFPE QC All-in-One Kit로 품질을 확인하였다. 또한, (B) 각 DNA 샘플에서 얻은 Long/Short ratio와 DIN 값을 그래프화 한 결과, Long/Short ratio와 DIN 값에 대한 상관관계가 높음 (R²=0.99)을 확인하였다.


그림 4. Takara FFPE QC All-in-One Kit로 측정한 데이터를 바탕으로 NGS library 제작을 위한 PCR 조건 설정 및 수율 개선 확인
(A) 본 제품으로 측정한 Long/Short ratio를 바탕으로 ThruPLEX Tag-Seq HV (library prep kit)의 standard 프로토콜 (Input양 10 ng, 9~10 PCR cycles)과 input 양 또는 cycle 수의 조건을 변경한 프로토콜을 나타낸 표이다. (B) Long/Short ratio가 다른 3종류의 FFPE 유래 DNA (0.30, 0.10, 0.04)를 사용하여 input 양 또는 cycle 수 조건을 변경하여 library를 제작한 결과, NGS에서 사용할 수 있는 충분한 양의 library를 생성할 수 있음을 확인하였다.


그림 5. ThruPLEX Tag-Seq HV library의 NGS 시퀀싱 결과
ThruPLEX Tag-Seq HV Kit를 사용하여 Long/Short ratio가 다른 DNA (0.30, 0.02)에서 standard 프로토콜 및 input 양 또는 cycle 수를 증가시킨 권장 프로토콜로 library 제작을 진행한 후 Illumina NextSeq 2000에서 시퀀싱을 진행하였다. 증폭의 재현성을 확인하기 위해 염색체 별 커버리지를 평가한 결과, input 양과 cycle 수를 변경한 프로토콜에서도 커버리지는 균일하게 나타났다. Takara FFPE DNA QC All-in-One Kit를 통해 측정한 Long/Short ratio를 기반으로 ThruPLEX Tag-Seq HV Kit의 증폭 조건을 최적화함으로써 안정된 library 수율을 확보할 수 있었으며, input 양 또는 cycle 수를 변경한 경우도 NGS 해석에 미치는 영향은 크지 않았다.

내용

보존 －20℃

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