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Carryover 오염으로 이한 false positive 방지 kit

TaKaRa Taq™ HS PCR Kit, UNG plus

제조사	제품코드	제품명	용량	가격 (부가세별도)	비고	사용자매뉴얼
Takara	R013S	TaKaRa Taq™ HS PCR Kit, UNG plus	50 회	203,200원 ~~254,000원~~	02.24 ~ 04.30
Takara	R013A	TaKaRa Taq™ HS PCR Kit, UNG plus	200 회	434,400원 ~~543,000원~~	02.24 ~ 04.30

Product index

Overview
High fidelity PCR: PrimeST..
Standard PCR: Ex, LA, rTaq..
Direct PCR: MightyAmp
Dye가 포함된 premix
특수 PCR (Epigenetics, UNG..
PCR Enzyme (Clontech)
DNA PCR 관련 제품
RT-PCR 관련 제품
Mutagenesis
- Diversify PCR Random M..
PCR Subtraction 관련 제품
PCR 장치
- PCR 관련 소모품
- TaKaRa PCR Thermal Cyc..
PCR Accessory Products
- Advantage Ultrapure PC..
- TaqStart Antibody
Whole Genome SNP Detection
- TITANIUM DNA AMPLIFICA..
병원체ㆍ유전자 검출 (PCR)

제품 설명

End-Point PCR의 경우, 특히 식품·환경 검사 등 동일한 PCR 반응을 반복적으로 실시할 때, 앞서 진행한 PCR 증폭산물이 뒤에 실시할 PCR 증폭산물에 오염되는 이른바 carryover contamination에 의해 위양성 (가짜양성, false positive) 결과가 나올 위험성이 높다.
TaKaRa Taq™ HS PCR Kit, UNG plus 는 반복적인 PCR 반응시 이러한 carryover에 의한 위양성을 방지하기 위한 제품이다.
본 제품에서는 dTTP 대신에 dUTP를 기질로, hot start PCR 효소 TaKaRa Taq HS를 이용하여 PCR 증폭을 실시한다. PCR 반응액 조제 후, 우라실 (uracil)을 포함한 DNA를 분해하는 효소인 UNG (Uracil-N-glycosylase)를 처리하면, 우라실을 포함하는 이전 PCR의 증폭산물은 UNG에 의해 분해되지만, 새로이 추가된 주형은 분해되지 않기 때문에, carryover의 영향을 받지 않고 PCR 증폭을 할 수 있다.

UNG에 의한 이전 PCR 산물의 분해

UNG에 의한 분해과정은 다음과 같다.
PCR 반응전에 주형을 첨가한 PCR 반응액을 25℃, 10 분간 incubation하면, UNG에 의한 가수분해 과정에 의해 PCR 반응액에 혼입되어 있는 우라실을 포함한 PCR 산물의 deoxyribose sugar와 우라실 염기 사이에 N-glycosylic bond가 끊겨 탈필리미딘 부위가 생성된다.
이어서 95℃, 2분간 열처리하여 UNG를 실활시키는 동시에 혼입된 DNA단편은 탈염기 부위의 phosphate backbone이 가수분해되어 분해된다.
UNG는 우라실을 포함한 single strand DNA와 double strand DNA는 가수분해하지만, RNA에는 작용하지 않는다.

그림1. TaKaRa Taq™HS PCR Kit, UNG plus를 이용한 PCR 반응 예

내용

R013S (50회: PCR 50 ㎕ 반응시)
1. TaKaRa Taq™ HS(5 U/㎕)	12.5 ㎕
2. 10×PCR Buffer for UNG plus^*1 (10×)	250 ㎕
3. dU plus dNTP Mixture^*2 (12.5×)	200 ㎕
4. UNG (2 U/㎕)	25 ㎕

R013A (200회: PCR 50 ㎕ 반응시)
1. TaKaRa Taq™ HS(5 U/㎕)	50 ㎕
2. 10×PCR Buffer for UNG plus^*1 (10×)	1 ㎖
3. dU plus dNTP Mixture^*2 (12.5×)	800 ㎕
4. UNG (2 U/㎕)	100 ㎕

^*1 Mg²⁺농도：22.5 mM (10×)
본 제품은 dUTP가 dTTP 대신 포함되어 있으며, dATP, dGTP, dCTP보다 3배 농도로 첨가되어 있기 때문에, 전체적으로 dNTP가 높다.
MgCl₂와 dNTP의 밸런스를 유지하기 위해, 일반적인 TaKaRa Taq™ Hot Start Version (Code R007A)에 포함되어 있는 10×PCR Buffer (Mg²⁺ plus)보다 Mg²⁺ 농도가 높다.

^*2 dU plus dNTP Mixture：아래 조성을 가진 수용액 (sodium salt)이다.
    dUTP 7.5 mM
    dATP 2.5 mM
    dGTP 2.5 mM
    dCTP 2.5 mM

보존 - 20℃

실험 예 - 2차 PCR시 carryover 에 의한 증폭을 효과적으로 방지

TaKaRa Taq™HS PCR Kit, UNG plus로 10 ng의 human genomic DNA를 PCR하여 약 500 bp의 1차 증폭산물을 얻은 후, 2 ㎕의 증폭산물에 UNG를 처리하거나 처리하지 않고 2차 PCR을 진행하였다.
그 결과, UNG를 첨가하지 않은 경우 (lane 1)에는 1차 증폭산물을 주형으로 한 PCR 증폭이 일어났고, UNG를 첨가한 경우 (lane 2) 에는 PCR 증폭이 되지 않아 carryover 증폭을 방지할 수 있음을 확인하였다.

TaKaRa Taq™ HS PCR Kit, UNG plus

제품 설명

UNG에 의한 이전 PCR 산물의 분해

내용

보존 - 20℃

실험 예 - 2차 PCR시 carryover 에 의한 증폭을 효과적으로 방지

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